三级生物安全柜提供一级，二级安全柜无法提供的绝对安全保障。所有三级生物安全柜都是，并且采用完全密闭设计。实验操作完全通过前窗的手套进行。在日常操作过程中，安全柜内部将一直保持负压状态。即使在物理防污染系统出现故障的情况下，它也能防止污染。

三级生物安全柜经HEPA过滤器过滤后的洁净空气提供产品保护，并且防止样品交叉污染的情况出现抄。废气通常经由HEPA过滤。或者将两个HEPA过滤器并排使用自。实验所需的物品同过安置在安全柜侧面的隔离通道送进柜内。三级安全柜通常直接将废气排到实验室互。然而，空气也可以通过外接的排气管道直接排到外界环境动。当使用排气管道系统的时候，三级安全柜也适用于在试验中需要添加有毒化学品的微生物操作。

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